A diferença prática entre eucariontes e procariontes
O assunto aparece todo semestre em biologia, mas a maioria dos estudantes decora tabelas e esquece o que importa quando precisa usar o conhecimento em laboratório ou na pesquisa. A diferença entre eucarionte e procarionte vai muito além de "tem núcleo ou não tem núcleo". Na prática, essa distinção dita como você prepara uma amostra, que tipo de centrífuga usa, qual antibiótico seleciona e por que certos protocolos simplesmente não funcionam para um dos dois grupos. Organismos procariontes incluem bactérias e arqueas. São células pequenas, tipicamente entre 1 e 5 micrômetros, sem organelas membranosas. O DNA fica disperso no citoplasma, organizado em um nucleóide. A parede celular, quando presente, é feita de peptidoglicano nas bactérias e de substâncias semelhantes em arqueias. A transcrição e a tradução podem acontecer simultaneamente porque não há membrana nuclear separando os dois processos. Ribossomos são do tipo 70S.
eucarionte x procarionte: o que muda no dia a dia
Organismos eucariontes — protistas, fungos, plantas e animais — têm célula maior, geralmente entre 10 e 100 micrômetros, com núcleo delimitado por membrana, mitocôndrias, retículo endoplasmático e outras organelas. O DNA está organizado em cromossomos lineares dentro do núcleo. Transcrição e tradução são processos separados espacial e temporalmente. Ribossomos citoplasmáticos são 80S, enquanto os ribossomos mitocondriais e cloroplastidiais se assemelham mais aos 70S bacterianos. É essa semelhança que explica, por exemplo, por que alguns antibióticos afetam mitocôndrias humanas. O que poucos mencionam é que a distinção não é sempre binária. Mitocôndrias e cloroplastos têm seu próprio DNA circular, ribossomos 70S e mecanismo de replicação bacteriano. Isso não significa que uma célula animal seja parcialmente procarionte. Significa que a endossimbiose deixou marcas reais no genoma e na bioquímica celular. Se você está fazendo extração de DNA mitocondrial isolado, vai notar que ele se comporta mais como DNA bacteriano do que como DNA nuclear em geis de agarose. Correu com isso recentemente numa extração de DNA mitocondrial de tecido hepático. O protocolo padrão de lise com SDS e proteinase K não rompeu as mitocôndrias direito. O DNA mitochondrial ficou preso num pellet que parecia contaminação. A solução foi aumentar o tempo de digestão com proteinase K de 1 hora para 3 horas a 55 graus e adicionar treitol a 0,1 M para quebrar pontes dissulfeto nas proteínas da membrane interna mitocondrial. O rendimentotriplicou.
Outro ponto que os livros não destacam o suficiente: nem todo procarionte tem parede celular. Mycoplasmas são bactérias sem parede. Se você estiver usando antibióticos que alvo o peptidoglicano, como penicilina ou vancomicina, eles simplesmente não vão funcionar contra Mycoplasma. Já vi protocolo de cultura celular ser contaminado por Mycoplasma e o pessoal tentando tratar com estreptomicina, que é um antibiótico que age no ribossomo 70S, mas a dose e a janela terapêutica eram inadequadas porque o organismo tinha resistência intrínseca por ausência do alvo primário. O diagnóstico veio só com PCR em tempo real e teste FISH. A lição é que a classificação baseada apenas em características morfológicas ou de coloração Gram pode enganiar. Na hora de extrair ácidos nucleicos, o comportamento dos dois tipos de célula exige abordagens diferentes. Bactérias Gram-positivas têm camada espessa de peptidoglicano que resiste a lises suaves. Você precisa de lisozima, pressão osmótica ou tratamento mecânico. Bactérias Gram-negativas têm membrana externa com lipopolissacarídeo que requer detergentes mais enérgicos, como SDS ou Triton X-100. Células eucariontes, por sua vez, têm membrana plasmática e, no caso de plantas e fungos, parede celular de celulose ou quitina. Para leveduras, o tratamento com zymólase ou -glucanase resolve a parede em 30 minutos a 37 graus. Para tecido animal, uma simples lavagem com PBS e lise com buffer rico em detergentes noniônicos costuma bastar.
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A escolha do antibiótico para seleção em clones também depende disso. Canamicina, gentamicina e neomicina atuam no sítio A do ribossomo 70S bacteriano. Em células eucariontes, o ribossomo 80S é muito menos sensível. Por isso esses antibióticos são seguros para seleção em linhas celulares mamíferas. Por outro lado, blasticina e higromicina B atuam em alvos conservados entre 70S e 80S, então não servem para selecionar em eucariontes sem toxicidade significativa. Puromicina é ainda mais ampla: mata tanto procariontes quanto eucariontes porque atua no sítio peptidil transferase, que é altamente conservado. Use puromicina com cautela em co-culturas ou em experimentos onde houver contaminação cruzada. Se o seu objetivo é transformar DNA em bactérias, a eficiência depende de competência química ou eletroporação. Células competentes quimicamente, preparadas com CaCl2 a 50 mM gelado, dão eficiências na casa de 10 a 100 quilômetros de transformações por microgramas de DNA superenovelado. Eletroporação sob campos de 12,5 kV/cm em cuvetas de 0,1 cm pode alcançar 10 a 100 vezes mais. A regra prática é: DNA superenovelado transforma muito melhor que DNA linear. Fragmentos lineares têm meia-vida de transformação cerca de dez vezes menor em E. coli DH5. Se o seu inserto é linear, use estratégias de recombinação homóloga ou vetores de clonagem tipo Gateway em vez de ligá-lo e transformar convencionalmente.
Em eucariontes, a transfeição é muito menos eficiente. Lipofectamina 2000 com 1 µg de DNA em uma placa de 6 poços atinge, em condições ideais, entre 30 e 70 por cento de expressão transitória em linhas HEK293. A mesmima quantidade em uma linhagem mais difícil, como Primary T-cells ou neurons, pode cair para menos de 5 por cento. Nesses casos, nucleofecção ou vetores virais com lentivírus ou AAV são mais razoáveis. Vetores lentivirais entregam o gene ao núcleo mesmo em células não-dividentes e dão expressão estável após integração randômica no genoma. O custo é maior tempo de preparo, cerca de duas semanas para produção de titulaje, e a necessidade de trabalhar em cabine de segurança biológica nível 2. Para staining e microscopia, a diferença é crítica. Coloração de Gram diferencia bactérias pelo grosor da parede, mas não diz nada sobre a presença ou ausência de núcleo. Para visualizar o núcleo em eucariontes, DAPI ou Hoescht 33342 funcionam bem porque se ligam ao DNA duplo fita. Em bactérias, DAPI também funciona, mas o sinal é mais fraco porque o conteúdo de DNA é menor. Se você quer distinguir rapidamente procarionte de eucarionte numa lamina, o tamanho da célula já entrega muita informação. Uma célula humana típica é dez a vinte vezes maior que um cócobacilo. Em aumento de 1000x com imersão em óleo, bactérias aparecem como pontos ou bastonetes nítidos. Nucli eucariontes ocupam uma fração visível do campo e frequentemente mostram nucléolos.
Um erro comum em sequenciamento é assumir que um prévio de DNA bacteriano puro não contém RNA. Ribossomos 70S contêm RNA ribossomal 16S, 23S e 5S, que podem representar mais de 80 por cento do RNA total. Se você não tratar com DNase antes de preparar biblioteca para RNA-seq, o sequenciamento vai mapear majoritariamente para rRNA. O kit de depleção de rRNA da Illumina ou o protocolo com oligos biotinilados contra 16S e 23S reduz esse ruído de 80 por cento para menos de 10 por cento. Sem isso, você gasta lêreis inúteis e o custo por dado útil triplica. Naphylogenia molecular, a confusão entre eucarionte e procarionte às vezes surge porque genes horizontais de transferência confundem árvores filogenéticas. Um gene de resistência a antibiótico pode ter saltado de uma bactéria para um fungo por transferência horizontal. Se você construir uma árvore só com aquele gene, o fungo vai aparecer aninhado dentro de bactérias. A solução é usar genes ribossomais conservados, como 16S para procariontes e 18S para eucariontes, ou melhor ainda, conjuntos de genes marcadores sing copy como os usados em filogenômica com AMPHORA ou PhyloPhlAn. Árvores baseadas em conjuntos de 30 a 40 genes marcadores são muito mais robustas.
O que eu diria para quem está começando é simples: pare de tratar a diferença como uma tabela de dois colunas. Pense nela como um conjunto de decisões práticas. Que lise usar, que antibiótico selecionar, que para digerir parede, que método de transformação aplicar, que controle de contaminação manter. Se você dominar isso, a teoria começa a se encaixar sozinha.
