Extracão e análise de material genético: o que funciona na prática
A extração de material genético parece simples até você receber 50 amostras para processar e começar a ver resultados estranhos nos géis. O protocolo básico envolve lisar as células, remover proteínas e precipitar os ácidos nucleicos. Parece direto, mas os detalhes determinam se você vai ter DNA de boa qualidade ou lixo que não serve nem para PCR. O método mais comum para células animais e tecidos é usar SDS e proteinase K na digestão. A proteinase K quebra as histonas e outras proteínas que ligam o DNA, enquanto o SDS dissolve as membranas lipídicas. Depois disso, a precipitação com acetato de sódio e etanol 100% isolha o DNA. A fase aquosa fica no topo e o DNA se deposita como um precipitado esbranquiçado que você pode recolher com uma ponta de pipeta. O tempo de digestão da proteinase K geralmente varia entre 30 minutos e 2 horas a 55 graus Celsius, dependendo do tipo de tecido.
Para micro-organismos com parede celular, como bactérias gram-positivas ou fungos, o SDS sozinho não resolve. Eu usei lisozima antes da digestão com proteinase K em amostras de Staphylococcus aureus. A lisozima quebra as ligações glicosídicas da parede peptidoglicânica e sem esse passo prévio, o rendimento de DNA caía pela metade em comparação com o protocolo padrão.
Como extrair material genetico de amostras complexas
Amostras ambientais ou com muitos inibidores de PCR são onde a extração realmente testa o operador. Humina, polissacarídeos e fenóis presentes em amostras de solo e plantas podem inibir polimerases. Nesses casos, a extração com CTAB (cloreto de cetiltrimetilamónio) é mais eficaz do que os kits comerciais baseados em colunas de sílica. O CTAB forma complexos com polissacarídeos que permanecem na fase orgânica durante a extração com clorofórmio, permitindo que o DNA fique na fase aquosa. Eu precisei lidar com amostras de solo que continham ácidos húmicos que inibiam completamente a PCR, mesmo após lavagens múltiplas. A solução foi uma extração com CTAB seguida de uma purificação adicional com acetato de potássio, que precipita os polissacarídeos residuais. O DNA obtido foi suficiente para sequenciação do gene 16S rRNA. A quantificação e a avaliação da qualidade do DNAextraído são etapas críticas. Espectrofotometria UV com NanoDrop mede absorbância em 260 nm para concentração e as razões 260/280 e 260/230 para pureza. Uma razão 260/280 entre 1,8 e 2,0 indica DNA livre de proteínas. Valores abaixo de 1,8 sugerem contaminação proteica. Valores de 260/230 abaixo de 2,0 indicam presença de fenol ou sais. A fluorescência com Qubit usando corantes específicos para DNA dupla fita fornece uma medição mais precisa da concentração real, pois não detecta RNA contaminante ou oligonucleotídeos livres.
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O gel de agarose continua sendo a forma mais prática de avaliar integridade. DNA genômico de alta qualidade aparece como uma banda compacta próxima ao poço, sem trail. Se você observar um trail descendente, o DNA está degradado. Isso pode ocorrer por nucleases presentes durante a extração ou por manipulação mecânica excessiva. Pipetar vigorosamente ou vortexar após a dissolução do DNA em tampão TE pode fragmentá-lo. A recomendação é resolver o pellet suavemente em tampão aquecido a 55 graus e pipetar apenas algumas vezes com ponta de corte largo. Um ponto que poucos mencionam: a presença de RNA pode ser confundida com baixo rendimento de DNA em medições espectrofotométricas. O RNA absorve fortemente em 260 nm e infla artificialmente a concentração medida. A solução é tratar a preparação com RNase A por 15 minutos a 37 graus antes da quantificação. Isso remove o RNA sem afetar o DNA. Sem esse tratamento, é comum superestimar a concentração em 30 a 40 por cento.
Para PCR, o DNA extraído precisa ter concentração mínima de 10 nanogramas por microlitro e comprimento médio superior a 10 quilobases. A espectrofotometria pode mostrar concentração suficiente, mas a fragmentação torna o DNA inútil para amplificação de regiões maiores. O gel de agarose nessa situação revela claramente o problema antes que você gaste reagentes caros em reações que vão falhar. Uma limitação importante dos kits de coluna de sílica disponíveis comercialmente é que eles retêm preferencialmente fragmentos acima de 400 pares de bases. Amostras com DNA parcialmente degradado, como as provenientes de biópsias formol-fixadas, podem ter rendimento extremamente baixo nesses kits. O DNA fragmentado passa direto pela coluna sem ser retido. Para esses casos, a precipitação com PEG 8000 é uma alternativa mais eficiente, pois consegue recuperar fragmentos tão pequenos quanto 100 pares de bases.
Armazenamento também merece atenção. DNA dissolvido em água pura tende a se degradar ao longo do tempo devido à acidificação do meio. O ideal é ressuspendê-lo em TE (Tris-EDTA) a pH 8,0 e armazenar a menos 20 graus Celsius. O EDTA quelata íons metálicos que seriam cofatores de nucleases residuais, enquanto o Tris mantém o pH estável. Amostras armazenadas em água pura perdem qualidade significativamente após seis meses, mesmo congeladas. O controle de contaminação é outro ponto onde iniciantes cometem erros. Reagentes de extração podem conter traços de DNA bacteriano ou humano. O uso de controle negativo de extração, processando um tubo com apenas tampão e reagentes sem amostra, revela essa contaminação de fundo. Se o controle negativo mostrar bandas no gel ou sinais no Qubit, os reagentes estão comprometidos e precisam ser trocados ou filtrados. Já me deparei com kit de extração cuja caixa de reagentes estava com validade próxima e o controle negativo apresentava DNA visível no gel. A substituição do lote resolveu o problema.
Para aplicações de sequenciação de nova geração, os requisitos são ainda mais rigorosos. Fragmentos com tamanho homogéneo e ausência completa de RNA, proteínas e sais são necessários. A extração com fenol-clorofórmio seguida de purificação em coluna de limpeza de DNA oferece a melhor qualidade nesse contexto, apesar de ser mais trabalhosa do que os kits prontos. O tempo total de uma extração convencional com fenol-clorofórmio fica entre duas e três horas, enquanto kits comerciais reduzem esse tempo para 30 a 45 minutos. O custo por amostra nos kits é significativamente maior, mas a economia de tempo costuma compensar quando se processam muitas amostras simultaneamente. Na prática, dominar a extração de material genetico exige entender quando seguir o protocolo cegamente e quando adaptar. Amostras padronizadas como linfócitos humanos e leveduras respondem bem a protocolos estabelecidos. Amostras complexas como solo, fezes, madeira e tecidos vegetais exigem ajustes específicos. Conhecer a natureza do tecido e os componentes que podem interferir na extração faz mais diferença do que simplesmente repetir protocolos sem questionamento.
