meristematico primario na prática de cultura de tecidos
O meristema apical é a primeira coisa que se pega ao tentar estabelecimento in vitro. A região compreende o promeristema, protoderme, meristema fundamental e procâmbio, todos organizados em duas camadas funcionais distintas no ápice do caule. A túnica cresce por divisões anticlinais, gerando camadas superficiais. O corpús entra com divisões periclinais e obliques, formando o córtex e a medula. Juntos, eles sustentam o crescimento primário em comprimento durante as primeiras semanas de cultivo.
por que o meristematico primario falha com frequência
Na minha experiência, o ponto que mais trava iniciantes não é a esterilização superficial. É o momento exato do explante. O meristematico primario ideal precisa estar entre 0,2mm e 0,5mm na borda da dome apical. Menor que isso, a taxa de contaminação fúngica interna aumenta drasticamente, porque o tecido ficou muito exposto durante o corte. Maior que isso, a responsividade a BAP cai pela metade, já que as células ainda não diferenciaram o padrão de divisa adequado. Eu costumo trabalhar com uma lâmina de barbear e um microscópio estéreo a 40x, cortando sob uma camada fina de água estéril para evitar desidratação durante a dissecação. Um caso específico que lembro: em um projeto de micropropagação de banana, os brotações paravam de crescer depois de três transferências. O meio estava correto, o pH estava em 5,7, nada de fenolização aparente. O problema era o tempo de fotoperíodo. Estávamos usando 16 horas de luz, mas as cultivares da série 'Prata' respondem melhor a 12 horas quando o meristema ainda está em fase de estabelecimento inicial. Mudei para 12h e a taxa de sobrevivência subiu de cerca de 30% para 72%. Sem pirotecnia, só ajuste prático.
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O meio de cultivo padrão para ativação do meristematico primario começa com MS completo, mais 30g/L de sacarose e 8g/L de agar. A parte que muita gente deixa de ajustar é a concentração de ferro. O EDTA ferro quelatado do MS padrão degrada com o tempo de autoclavagem. Eu prefiro preparar uma solução estoque de 10x, filtrar em membrana de 0,22µm e adicionar após a autoclave, mantendo a concentração final em 27,8mg/L. Isso evita que o crescimento seja limitado por deficiência de ferro mesmo quando o meio parece estar perfeito. Também é importante notar que a adição de ativadores de carbono não melhora o crescimento do meristema de forma linear. O caso clássico é o extrato de levedura. Em concentrações acima de 200mg/L, ele inibe a proliferação em vez de estimular. Eu trabalho com 100mg/L como teto seguro para a maioria das espécies dicotiledôneas. Para monocotiledôneas, como cana-de-açúcar, o teto costuma ficar em 50mg/L, senão a indução de calos parasita o desenvolvimento do meristema.
A transplantação para o solo é onde a maior parte do material morre, não no laboratório. A razão é simples: o meristematico primario gera raízes adventícias com sistema vascular incompleto quando cultivado sem auxina na fase de enraizamento. Essas raízes de laboratório têm baixa capacitância hidráulica. Ao para substrato, a perda de água pelo transpire exceeds a capacidade de absorção em questão de horas. O procedimento que funciona para mim é enraizar em 1/2 MS sem adição de auxina exógena, transferir para vaso com substrato de turfa e perlita em proporção 1:1, e cobrir com saco plástico transparente por 10 dias. Manter a umidade relativa acima de 85% durante esse período reduz a mortalidade em torno de 60% comparado à transferência direta. Outro detalhe técnico que ninguém comenta direito: a qualidade da água. Água destilada comum tem íons de silicato em níveis suficientes para interferir na disponibilidade de fósforo no meio. Se o seu meio MS está com precipitado esbranquiçado no fundo do frasco antes da autoclavagem, troque para água deionizada com resistividade superior a 1M·cm. Isso elimina uma causa silenciosa de crescimento deficiente que muitos atribuem erroneamente à contaminação ou à senescência do explante.
O crescimento do meristematico primario também é sensível à densidade de explantes por frasco. Colocar mais de cinco meristemas em um frasco de 250mL com 30mL de meio gera competição por oxigênio dissolvido. A concentração de O no meio cai abaixo de 2mg/L, e o tecido entra em metabolismo fermentativo. Os sinais são escurecimento da base do explante e liberação de bolhasscópicas presas entre as camadas celulares. A recomendação prática é no máximo três meristemas por frasco, ou aumentar o volume do meio para 50mL. Quando o protocolo está correto, a taxa de multiplicação para a maioria das espécies comerciais varia entre 2,5 e 4,0 novos meristemas a cada 21 dias de subcultivo. Valores acima de 5,0 normalmente indicam indução de calos em vez de propagação meristemática propriamente dita. Calos são úteis para transformaçao genética, mas geram variabilidade somaclonal indesejada em propagação comercial. Monitorar a morfologia dos explantes a cada transferência, e não apenas a quantidade, é o que separa um laboratório que produz clones fiéis de um que produz misturas genéticas sem controle.
