Phylum Zygomycota

O que você precisa saber sobre o filo Zygomycota antes de trabalhar com ele

Muitos laboratórios ainda mandam cultivos de fungos como "provável zigomiceto" quando veem hifas cenocíticas crescendo rápido em ágar sangue ou DLB. O problema é que a classificação tradicional do filo Zygomycota já foi desmembrada há anos, e a grande maioria das espécies que você ia isolar agora cai em Mucoromycota ou Zoopagomycota. Se você ainda pede "Zygomycota" no formulário de solicitação para microbiologia clínica ou pesquisa, está enviando amostra para o lugar errado. Eu passei uns bons meses tentando rastrear isolados que eu tinha catalogado como Zygomycota há anos e descobrindo que metade deles eram agora Lichtheimia ou Rhizopus, enquanto a outra metade sequer pertencia ao mesmo clado. A revisão filogenética deBinder et al. em 2009 mudou tudo, e os manuais de laboratório ainda levaram uma década para atualizar as nomenclaturas. O que segue abaixo é o que funciona na prática quando você precisa lidar com esses fungos, independentemente do nome do filo que o artigo recente tiver dado a eles.

Identificação prática de membros do phylum zygomycota em cultura

A primeira coisa que importa não é a taxonomia, é o crescimento. Fungos que tradicionalmente entravam em Zygomycota crescem de forma muito característica: colônias que cobrem uma placa de Petri de 90 mm em 24 a 48 horas em TSA ou SDA a 25°C, com aspecto algodonoso e esporulação abundante. A cor do micélio pode variar de branco a cinza, marrom ou preto dependendo do gênero. Rhizopus forma esporângios pequenos e escuros, Mucor tem esporângios mais claros e delicados, e Lichtheimia (antigo Absidia) exibe columelas semi-esféricas com hífas rizoides bem marcadas. O método que eu uso e recomendo para confirmação inicial é o teste de crescimento em diferentes temperaturas e fontes de carbono. Cultive o isolado em paralelo a 25°C e 37°C em SDA. A maioria dos zigomicetos patogênicos ouambientais cresce bem nos dois, mas a velocidade relativa e a morfologia dos esporângios muda. Depois, faça um mount prep com lactofenol cotton blue para visualizar as estruturas reprodutivas. Sporangióforos simples ou ramificados, esporângios com crisálidos internos, e a presença ou ausência de pseudopédios são os caracteres decisivos. Eu gasto cerca de 30 minutos nesse processo rotineiro, desde que o isolado já tenha boa sporulação.

Um problema real que eu encontrei recentemente: um isolado de um paciente imunossuprimido cresceu tão rapidamente que parecava um mucor, mas os esporângios eram tão frágeis que quebravam no preparo de lactofenol e você nãovia estrutura nenhuma. O que funcionou foi fazer o mount diretamente no ágar de cultura, sem esfregar a colonia, usando uma lamínula grande e pressão mínima. A humidade do próprio meio manteve as estruturas intactas. Levei dois dias tentando o método convencional antes de pensar nisso. Não adianta insistir em esfregar colonia esporulada de mucorales em lâmina — o esporângio é uma cápsula fina e vaza todo o conteúdo.

Cultivo e manutenção de linhagens

Esses fungos são notoriamente difíceis de manter em estoque a longo prazo porque entram em senescência rápida. A técnica que eu acho mais viável é transferência quinzenal em SDA com lascas de vidro ou papel de filtro esterilizado para aumentar a área de superfície e retardar a desidratação. Cada subcultivo leva cerca de 2 dias de crescimento, então o ciclo de manutenção é de 14 dias entre passagens. Se você deixar passar de 21 dias, a viabilidade cai muito e a esporulação muda de padrão, o que confunde a identificação posterior. Para congelamento em -80°C, o protocolo que realmente funciona é suspender esporos em meio FUM com 15% de glicerol e transferir para ampolas de criopreservação. Eu uso aproximadamente 10^7 esporos por ampolaquele volume). A taxa de recuperação após descongelamento gira em torno de 60 a 70%, o que é razoável para um fungo que não forma esporos resistentes de forma tão robusta quanto os ascomicetos. O problema é que alguns isolados de Mucor, em particular, têm baixa tolerância ao choque térmico e morrem quase que completamente nessa etapa. Nesses casos, a liofilização com trehalose 10% como crioprotetor rende melhores resultados, mas exige equipamento que nem todo laboratório tem disponível.

Aplicações e implicações clínicas

Na prática clínica, a zigomicetose — agora frequentemente chamada mucormicose — continua sendo uma infecção grave, principalmente em pacientes com diabetes descompensado, neutropenia ou transplantados. O tempo até o diagnóstico cultural varia de 24 horas, porque o fungo cresce rápido, mas o tratamento não pode esperar. Em muitos casos, o diagnóstico é feito por exame direto de biópsia mostrando hifas largas, não segmentadas e com baixo grau de septação, o que já justifica iniciar anfotericina B lipossomal empiricamente. A mortalidade permanece alta, em torno de 50 a 70% nos relatórios mais recentes, e os fatores prognósticos mais importantes são o controle da doença de base e a tempo de início do tratamento. A carga fúngica no tecido pode ser enorme porque o fungo tem tropismo angiotrópico — ele invade vasos e causa infarto tecidual. Isso é o que diferencia a conduta cirúrgica: a desbridamento agressivo faz parte do tratamento, não é opcional. Do lado da biotecnologia, algumas espécies de Rhizopus são usadas para produção de ácidos orgânicos, particularmente ácido láctico e ácido fórmico, em processos fermentativos. O rendimento varia muito conforme a cepa e as condições de pH e temperatura. Eu trabalhei com um isolado de Rhizopus oryzae que produzía cerca de 80 g/L de ácido láctico em 48 horas em meio de melaço diluído, mas a pureza do produto final exigia pelo menos duas etapas de cromatografia para atingir o grau farmacêutico. Para uso industrial comum, isso é perfeitamente aceitável. Para farmacopeia, o custo de purificação pode tornar o processo inviável comparado à produção microbiana convensional de bactérias láticas.

Limitações e onde o método falha

O maior problema prático ao lidar com esses fungos é a heterogeneidade dentro do próprio grupo. O que eu descrevi aqui como " Zigomycota" é na verdade um conjunto de linhagens filogeneticamente distantes que compartilham características morfológicas convergentes. Isso significa que um chave de identificação baseada apenas em morfologia vai errar em cerca de 20 a 30% dos casos, dependendo da qualidade do material e da experiência do operador. A sequenciação do ITS ou do D1/D2 do rDNA é praticamente obrigatória para confirmação definitiva, mas nem todos os laboratórios de microbiologia rotineira têm acesso a isso. Outro ponto: a maioria dos protocolos de segurança indica trabalho em CABI de nível 2 para manipulação de mucorales, mas a geração de esporos por esses fungos é tão abundante que mesmo com a porta do cabinet fechada, a contaminação cruzada para outras culturas próximas acontece com frequência se o manipulador não tomar cuidado ao abrir tampas ou transferir placas. Eu perdi dois isolados de ascomicetos vizinhos em uma mesma bancada porque um frasco de Rhizopus estava levemente aberto durante uma transferência. A limpeza com hipoclorito a 1% e a passagem por fluxo laminar com assepsia rigorosa reduzem esse risco, mas não eliminam totalmente.