O que são proteínas conjugadas na prática
Proteínas conjugadas são proteínas que possuem um grupo químico não proteico ligado covalentemente à cadeia polipeptídica. Esse grupo é chamado de grupamento prostético. Sem ele, a proteína simplesmente não funciona. A albumina da clara do ovo é só proteína. A hemoglobina é proteína mais heme. A diferença entre elas é o que dá a funcionalidade real.
Como identificar e classificar proteinas conjugadas
A classificação mais usada ainda é a clássica: lipoproteínas, glicoproteínas, metaloproteínas, nucleoproteínas, fosfoproteínas e cromoproteínas. Cada uma carrega um tipo diferente de grupamento prostético. Lipoproteínas transportam lipídios. Glicoproteínas têm carboidratos ligados. Metaloproteínas dependem de íons metálicos. Nucleoproteínas carregam ácidos nucleicos. Fosfoproteínas têm fosfato ligado. Cromoproteínas têm pigmentos. O detalhe que todo mundo esquece é que o grupamento prostético pode mudar completamente a solubilidade da proteína. Uma glicoproteína se comporta de forma totalmente diferente em cromatografia de exclusão molecular comparada à sua forma aglicosilada. O carboídate adiciona hidratação, altera o tempo de retenção e muitas vezes mascara epítopos em ensaios imunológicos. Se você está purificando uma glicoproteína e o rendimento cai pela metade após tratamento com peptideídeos, provavelmente removeu parte do glicano ou desnaturou o sítio de ligação.
Na prática, a primeira coisa que eu faço ao receber uma proteína conjugada desconhecida é rodar um teste de Bradford combinado com um teste de fenol-ácido sulfúrico para carboidratos e um espectro UV-Vis básico. Se houver absorção em 280 nm com um pico adicional em 410 ou 540 nm, tem grupo prostético cromóforo. Isso economiza horas de caracterizaçao por MS.
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Problemas reais que aparecem no laboratório
Eu tive um caso com uma ATPase dependente de magnésio que parecia pura no SDS-PAGE, mas a atividade enzimática estava erraticamente baixa. A proteína era uma metaloproteína e o magnésio havia sido quelado durante a purificação por causa do EDTA no tampão de lise. O problema era simples: o magnésio era o grupamento prostético funcional e ele tinha sido removido. A correção foi adicionar 5 mM MgCl diretamente no tampão de eluição e rodar uma troca de tampão em coluna Sephadex G-25 para remover o EDTA residual. A atividade voltou para 85% do esperado em 30 minutos. Outro problema comum é a oxidação de grupos heme. Hemoproteínas purificadas podem perder o ferro se expostas a luz e oxigênio por muito tempo. A solução básica é trabalhar sob luz fraca e adicionar 0,1 mM de ascorbato como antioxidante no tampão de armazenamento. Sem isso, o rendimento de proteína funcional cai drasticamente em menos de 24 horas a 4°C.
Limitações que ninguém menciona
Proteínas conjugadas são intrinsicamente mais difíceis de expressar heterologamente do que proteínas simples. O sistema de expressão precisa ser capaz de procesar o grupamento prostético adequadamente. Sistemas bacterianos como E. coli frequentemente não fazem glicosilação corretamente. Você acaba com uma proteína aglicosilada que pode ser solúvel mas biologicamente inativa. Nesse caso, sistemas de inseto com baculovírus ou células mamíferas são a alternativa real, não apenas uma opção de luxo. A purificação também é mais complicada. Colunas de afinidade padrão frequentemente não capturam a proteína na forma corretamente dobrada se o grupamento prostético estiver ausente. A proteína pode ainda se ligar à resina mas na conformação errada. O controle de qualidade precisa incluir testes funcionais, não apenas pureza por gel. Pureza de 95% em SDS-PAGE sem atividade medida é informação incompleta para uma proteína conjugada.
Quando evitar métodos padrão
Se sua proteína conjugada é uma fosfoproteína e você precisa mapear os sítios de fosforilação, o tratamento com ácido perclórico a 5% para hidrólise e análise por cromatografia líquida é mais confiável que fosfatase alcalina seguida de espectrometria. A fosfatase alcalina tem tendência a remover grupos fosfato de forma incompleta e gera subprodutos que atrapalham a ionização no MS. O método ácido é mais trabalhoso mas dá resultados reprodutíveis em praticamente qualquer laboratório com HPLC básico. Para nucleoproteínas, a desnaturação com fenol-clorofórmio ainda é o padrão ouro para separar o ácido nucleico da proteína. Métodos enzimáticos com proteinase K são mais lentos e deixam resquícios de enzima que interferem em ensaios posteriores. Leva cerca de 45 minutos fazer a extração com fenol versus 3 horas com digestão enzimática, e a qualidade da proteína recuperada é superior nos dois casos.
