Sintese Proteica

O que realmente acontece quando você tenta expressar uma proteína

A síntese proteica é um processo trivial se você souber o que está fazendo e um pesadelo completo se não souber. A maioria dos protocolos que você encontra na internet trata isso como se fosse seguir uma receita de bolo. Não é. Cada plasmídeo, cada linhagem bacteriana, cada lote de meio de cultura se comporta de forma diferente. O que funcionou semana passada pode não funcionar hoje sem nenhum motivo aparente. O processo básico é simples de descrever. Você tem um gene de interesse clonado em um vetor de expressão, transfere esse vetor para uma célula hospedeira — tipicamente E. coli — e a maquinaria celular começa a traduzir o mRNA em proteína. A complexidade surge nos detalhes práticos. Seleção do vetor certo, condições de indução, temperatura, tempo de expressão, solubilidade do produto final. Cada um desses pontos pode fazer sua proteína ficar inclusa ou ser degradada.

Como otimizar a síntese proteica para expressar proteínas solúveis

Quando eu estava trabalhando com uma quinase de membrana que precisava purificar para estudos estruturais, passei cerca de três semanas tentando expressá-la em BL21(DE3) com IPTG padrão. Sempre formava inclusões. O que eu não estava considerando era que a proteína era codificada por um organismo mesófilo e a expressão em 37°C estava fazendo ela dobrar rápido demais, antes de ter a chance de adotar a conformação correta. Mudei a temperatura de indução para 18°C e usei 0,2mM de IPTG em vez do habitual 1mM. A proteína ficou solúvel. O rendimento caiu pela metade, mas pelo menos era proteína nativa, não um aggregate insolúvel. Isso te dá uma ideia do tipo de ajuste fino que é necessário. Não existe protocolo universal. O que você precisa fazer é controlar variáveis individualmente. Comece testando diferentes temperaturas de indução — 37°C, 25°C, 18°C. Teste diferentes concentrações de indutor. Teste diferentes tempos de indução. Anote tudo. Sem registro detalhado, você não consegue reproduzir nada.

Outro ponto que poucos mencionam: a densidade celular no momento da indução importa mais do que a maioria dos protocolos sugere. Se você induz uma cultura que já está em fase estacionária, as células estão metabolicamente comprometidas e a eficiência de tradução cai drasticamente. O ideal é induzir quando o OD600 estiver entre 0,6 e 1,0. Isso varia dependendo da linhagem e do meio, então meça sempre.

Sistemas de expressão e quando usar cada um

E. coli continua sendo o trabalho padrão para síntese proteica porque é rápido, barato e bem caracterizado. Mas ela tem limitações sérias. Não faz modificações pós-traducionais eucarióticas como glicosilação. Forma inclusões com frequência com proteínas eucarióticas. A taxa de tradução é muito alta, o que pode levar ao misfolding. Para proteínas que precisam de glicosilação ou outras modificações complexas, sistemas como baculovírus em células de inseto ou células HEK293 são necessárias. O tempo aumenta de horas para dias, e o custo sobe significativamente. Células de inseto com o sistema Bac-to-Bac dão boa expressão e glicosilação básica, mas o padrão de glicosilação ainda difere do humano. Se você precisa de algo clinicamente relevante, vai para linhas celulares mamíferas.

Existe também o sistema cell-free de síntese proteica. É essencialmente um extrato de E. coli ou reticulocito que contém todos os componentes para tradução, mas sem células intactas. A vantagem é que você pode inserir aminoácidos não-canônicos, expressar proteínas tóxicas para células vivas, e o processo é extremamente rápido — minutos em vez de horas. A desvantagem é o custo. O extrato cell-free pronto para uso custa cerca de 50 a 100 dólares por reação de 50 microlitros. Para projetos de screening rápido ou proteínas difíceis, compensa. Para produção em larga escala, não.

Purificação e o problema das proteases

Depois de expressar a proteína, você precisa lisar as células e purificar o produto. A lise por ultrassom ou homogeneização pressurizada é padrão. O problema é que, assim que a célula se rompe, as proteases endógenas são liberadas e começam a degradar sua proteína. Eu perdi amostras inteiras porque esqueci de adicionar inibidores de protease no buffer de lise. Parece bobo, mas acontece com frequência. Se sua proteína tem um tag de purificação — His-tag é o mais comum — a cromatografia de afinidade por níquel é o primeiro passo. O eluído vai vir sujo com proteínas hospedeiras, mas seu protein de interesse estará concentrado. Depois vem a cromatografia de exclusão molecular para trocar o buffer e remover agregados. Se você precisa de proteína livre de tag, adicione um sítio de clivagem para TEV protease entre o tag e a proteína. A TEV é específica o suficiente para cortar apenas no sítio desejado, e o tratamento é feito overnight a 4°C.

Um problema recorrente com His-tags é que proteínas com histidinas naturais na superfície também podem se ligar à coluna de níquel. Se sua proteína tem muitos resíduos de histidina expostos, considere usar uma coluna Co2+ em vez de Ni2+, ou trocar para um tag GST ou MBP. A diferença de especificidade pode ser crucial.

Rodagem e análise de sucesso

Depois de tudo, você precisa verificar se a proteína foi expressa e se está pura. SDS-PAGE é o método padrão. Você carrega amostras da cultura antes e depois da indução, do sobrenata e do pellet de lise. Se a banda no tamanho esperado aparece fortemente após a indução e está presente no sobrenata, parabéns. Se está no pellet, sua proteína está em inclusões e você precisa considerar desnaturação e renaturação, ou otimizar as condições de expressão novamente. Western blot confirma a identidade da proteína se você tiver um anticorpo contra o tag ou contra a proteína em si. DLS e SEC-MALS dão informações sobre monodispersidade e peso molecular. Para estudos estruturais, cristalografia ou criomicroscopia eletrônica exigem pureza acima de 95% e homogêiedade conformacional. Se a amostra oscila no DLS, crystallização vai ser impossível, não importa quão pura seja por SDS-PAGE.

O processo de síntese proteica bem-sucedida é Basicamente isso. Escolha o sistema certo, otimize as condições para seu gene específico, limpe com cuidado, verifique a qualidade. Se algo der errado, o problema quase sempre está em uma variável que você não controlou adequadamente. Teste uma coisa de cada vez, registre tudo, e tenha paciência. Protéina boa não se apressa.